《南镰仓高校女子自行车社》的动漫剧情围绕着一群热爱自行车的高中女生展开。故事的主角是舞春祐美，一个从长崎搬到镰仓的高中新生。她对自行车充满憧憬，但实际上并不会骑车。在第一天上学的路上，她险些撞上人，幸得秋月巴的帮助，两人因此结缘。巴决定帮助祐美学会骑自行车，祐美也逐渐对自行车产生了兴趣。

她们所在的南镰仓高中，有着浓厚的自行车文化，祐美和巴在新任老师兼自行车爱好者森四季的指导下，与神仓冬音、比嘉夏海等其他对自行车有兴趣的女生一起，组建了女子自行车社。她们在镰仓这个充满历史韵味的小镇中，骑着自行车穿梭于各个角落，享受青春的美好。

在自行车社的活动中，她们不仅锻炼了身体，还学会了许多关于自行车的知识，如骑乘姿势、补充能量的重要性、速度与风阻的关系等。每一次骑行都是一次成长，她们之间的友情也在这个过程中愈发深厚。